1、原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其**學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其**學(xué)活性，又保留酶的活性。受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)反應(yīng)也結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了**反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

2、特點(diǎn)

某些分泌型蛋白，用siRNA 干擾后可以用ELISA 進(jìn)行檢測(cè)。

3、ELISA 實(shí)驗(yàn)流程示圖（以雙抗體夾心法為例）
 

4、試劑與耗材

（1） 包被緩沖液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液）：

（2）洗滌緩沖液 （pH 7.4，0.15 M PBS）：

（3）稀釋液：

（4）終止液（2 M H₂SO₄）：

（5）底物緩沖液 （pH 5.0）：

（6）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）使用液：

（7）2，2’-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：

（8）抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體：按說(shuō)明書處理。

（9）標(biāo)準(zhǔn)品：用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。

（10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶標(biāo)板）。
 

2、實(shí)驗(yàn)步驟（雙抗體夾心法）：

（1）包被：用包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10 μg/mL。在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加0.1mL，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

（2）加樣：加一定濃度稀釋的待檢樣品（同時(shí)做空白對(duì)照，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照）0.1 mL于上述已包被的反應(yīng)孔中，置濕盒中，37℃， 1 hr。用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

（3）加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體 （經(jīng)滴定后的稀釋度） 0.1ml。

37℃，0.5 - 1 hr，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

（4）加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。

（5）終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入終止液0.05 mL。

（6）結(jié)果判定：將酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀上，于450 nm （若ABTS 顯色，讀410 nm），讀數(shù)，輸出到Excel 中。

（7）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程式，根據(jù)公式計(jì)算未知樣品的濃度，并記錄。