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技術(shù)文章

elisa法酶聯(lián)**吸附測定實(shí)驗(yàn)步驟
elisa法酶聯(lián)**吸附測定實(shí)驗(yàn)步驟
試劑
  1. 碳酸鹽包被緩沖液: 3.03g Na2CO3, 6.0g NaHCO3, 溶解于900ml雙蒸水中，檢測并調(diào)整pH至9.6，定容至1L；
  2. PBS：1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl ，溶于500mL 蒸餾水中，調(diào)整pH至7.4；
  3. 封閉液：溶于PBS的1% BSA，血清，脫脂牛奶，酪蛋白或明膠等。
  4. 洗滌液：PBS或是TBST（Tris-HCl,pH7.4 + 0.05% 吐溫20）
  5. 抗體或抗原稀釋液：1×封閉液
  6. 終止液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測系統(tǒng)可采用不同的終止液。
實(shí)驗(yàn)步驟
  1. 直接法
    1. 確定抗原濃度和包被抗原：
      1. 采用十字交叉連續(xù)稀釋分析法確定抗原濃度，抗原濃度一般為0.2 to 10μg/ml，*好不要超過20μg/ml。
      2. 將50μl用碳酸鹽包被緩沖液稀釋的抗原加入96孔酶標(biāo)板中，用塑料膜板將孔板覆蓋后置于室溫2小時或4度過夜。
      3. 棄去包被液用洗滌液洗滌3次，輕拍孔板使洗滌液甩干。
    2. 封閉
      1. 每孔中加入200μl封閉液（1%BSA或5%脫脂牛奶等），蓋上膜板，室溫封閉至少2小時或4度過夜。
      2. 封閉后用PBS洗滌兩次。
    3. 抗體孵育
      1. 每孔加入稀釋好的抗體100μl，室溫孵育2小時或4度過夜。
      2. 孵育后用洗滌液洗滌四次。
    4. 檢測

      每孔加入100μl的底物溶液，待顯色充分后加入100μl的終止液并在酶標(biāo)儀上測定相應(yīng)波長吸光度值。

  2. 間接法
    1. 確定抗原濃度和包被抗原：
      1. 采用十字交叉連續(xù)稀釋分析法確定抗原濃度，抗原濃度一般為0.2 to 10μg/ml，*好不要超過20μg/ml。
      2. 將50μl用碳酸鹽包被緩沖液稀釋的抗原加入96孔酶標(biāo)板中，用塑料膜板將孔板覆蓋后置于室溫2小時或4度過夜。
      3. 棄去包被液用洗滌液洗滌3次，輕拍孔板使洗滌液甩干。
    2. 封閉
      1. 每孔中加入200μl封閉液（1%BSA或5%脫脂牛奶等）室溫封閉至少2小時或4度過夜。
      2. 封閉后用PBS洗滌兩次。
    3. 一抗和二抗孵育
      1. 每孔加入100μl稀釋好的一抗，蓋上膜板，室溫孵育2小時。
      2. 孵育后洗滌液洗滌四次。
      3. 加入100μl稀釋好的標(biāo)記二抗，繼續(xù)孵育1-2小時。
      4. 洗滌液洗滌四次。
    4. 檢測

      每孔加入100μl的底物溶液，待顯色充分后加入100μl的終止液并在酶標(biāo)儀上測定相應(yīng)波長吸光度值。

  3. 抗體夾心法
    1. 包被抗體
      1. 將50μl用碳酸鹽包被緩沖液（pH 7.4）稀釋的抗體加入96孔酶標(biāo)板中，一般抗體濃度為1-10μg/ml。
      2. 蓋上膜板包被4度過夜。
      3. 棄去包被液用洗滌液洗滌2次，輕拍孔板使洗滌液甩干。
    2. 封閉，加入樣品
      1. 每孔中加入200μl封閉液（1%BSA或5%脫脂牛奶等）室溫封閉1-2小時或4度過夜。
      2. 每孔加入100μl稀釋好的樣品，37度孵育90分鐘。
      3. 甩去孔板里面的溶液，洗滌液洗滌2次。
    3. 孵育檢測抗體和二抗
      1. 每孔加入100μl稀釋好的檢測抗體，室溫孵育2小時。
      2. 孵育后洗滌液洗滌四次。
      3. 每孔加入100μl稀釋好的標(biāo)記二抗，繼續(xù)室溫孵育1-2小時。
      4. 孵育后洗滌液洗滌四次。
    4. 檢測

      每孔加入100μl的底物溶液，待顯色充分后加入100μl的終止液并在酶標(biāo)儀上測定相應(yīng)波長吸光度值。

  4. 直接細(xì)胞ELISA
    1. 胰酶消化并收集細(xì)胞，采用十字交叉連續(xù)稀釋分析法確定細(xì)胞個數(shù)和標(biāo)記抗體的濃度。
    2. 將消化下來的細(xì)胞4度離心，1500rpm，5min。
    3. 細(xì)胞重懸并計數(shù)。
    4. 每孔100μl細(xì)胞懸液加入酶標(biāo)板中，1500rpm離心1min后將上清液真空吸干。
    5. 用100μlPBS稀釋的抗體標(biāo)記物溶液重懸細(xì)胞，4度孵育90分鐘。
    6. 孵育后4度1500rpm離心1分鐘，用洗滌液重懸，重復(fù)三次。
    7. 每孔加入100μl底物溶液并室溫孵育1小時。
    8. 顯色并測定吸光度值。
  5. 間接細(xì)胞ELISA
    1. 將細(xì)胞樣品4度離心，1500rpm，5min。用洗滌緩沖液重懸，使細(xì)胞密度為1-5 × 106個/ml。
    2. 采用十字交叉連續(xù)稀釋分析法確定細(xì)胞個數(shù)和標(biāo)記復(fù)合物的濃度。
    3. 每孔100μl細(xì)胞懸液加入酶標(biāo)板中，1500rpm離心1min后將上清液真空吸干。
    4. 每孔用100μlPBS稀釋的檢測抗體溶液重懸細(xì)胞，4度孵育90分鐘。
    5. 每孔加入100μlPBS稀釋的酶-抗體復(fù)合物，4度孵育90分鐘。
    6. 重懸，洗滌三次。
    7. 每孔加入100μl底物溶液并室溫孵育1小時。
    8. 顯色并測定吸光度值。
問題與解決方案
問題 可能的原因 解決辦法
高本底 孵育時間過長 縮短孵育時間
洗滌不充分 增加洗滌次數(shù)
緩沖液污染 配制新的緩沖液
標(biāo)記復(fù)合物濃度過高 適當(dāng)調(diào)整稀釋倍數(shù)
封閉不充分 調(diào)整封閉時間和封閉液濃度
不顯色 試劑加入順序錯誤或配制錯誤 檢查所用試劑是否正確
抗體量不夠 適當(dāng)增加抗體濃度
緩沖液或試劑污染 新制試劑和緩沖液
嵌合抗體未嵌合至板底 使用新的酶標(biāo)板
緩沖液中含有使抗體重組的成分 重新選擇緩沖液組分
顯色太深 含有未結(jié)合的底物 增加洗滌次數(shù)
底物溶液混合過早 底物溶液在使用前迅速混合
標(biāo)記復(fù)合物濃度過高 適當(dāng)稀釋標(biāo)記復(fù)合物
封閉液或試劑重復(fù)使用 使用新配制的試劑和封閉液
緩沖液污染 新制緩沖液
顯色太淺 測定波長錯誤 檢查測定波長
顯色時間不夠 增加顯色時間
包被孔板過期 使用新的孔板
目的蛋白未表達(dá)或表達(dá)量過少 如果表達(dá)量少可適當(dāng)增加樣品濃度，如不表達(dá)可選擇其他樣品提取
抗體量不夠 適當(dāng)增加抗體濃度
孵育溫度過低 檢查孵育溫度
試劑過期或pH值不對 檢查試劑配制方法
邊緣效應(yīng) 溫度變化過大 保持實(shí)驗(yàn)溫度比較恒定
曲線漂移 實(shí)驗(yàn)過程不連續(xù) 連續(xù)操作
試劑未處于室溫 確保所用試劑在使用前都恢復(fù)室溫
使用指南 付款方式 客戶關(guān)懷 **與保密 法律幫助 服務(wù)條款 監(jiān)察中心信箱
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